PARP immunhisztokémia és germinális BRCA státusz összefüggésének vizsgálata petefészekrákos esetekben

Bevezetés

A petefészekrák kialakulásában szerepet játszhat az emberi szervezetben tumorszuppresszorként működő BRCA-1, és -2 gének specifikus örökölt mutációja. A BRCA-1 gén a 17-es kromoszóma hosszú karján található. A gén több mint 500 azonosított aminosavsorrend-változata közül 80% ún. frameshift mutáció. A BRCA-2 gén a 13-as kromoszóma hosszú karján található. A génnek eddig közel 300 eltérését fedezték fel, ám ezek nagy részének kóroki szerepe nem igazolódott. A két gén termékei segítenek kijavítani a sérült kettősszálú DNS-szakaszt, a sejt genetikai stabilitását biztosítják. Sérülésük az általuk termelt proteinek funkcióvesztéséhez, vagy hiányához is vezethet. Családi halmozódású petefészekrák leggyakrabban a highgrade serosus cystadeno­carci­noma típus esetében fordul elő (1).

A BRCA-1 gén mutációját hordozó nők 39%, míg a BRCA-2 gén mutációját hordozó nők esetében 11-17% az esély a petefészekrák kialakulására 70 éves korig. Együttesen a petefészek-daganatok körülbelül 15%-át okozzák, de a petefészekrákos esetek 5%-ában e gének mutációja csak a tumorszövet sejtjeiben van jelen (szomatikus BRCA-mutáció) (2).

A PARP (poli-ADP-ribóz-polimeráz) enzimcsalád a szimpla szálú DNS-sérülések kijavításában vesz részt. Az enzim a sérülést detektálva a DNS törvégeihez kötődik, és poli-ADP-ribóz láncot szintetizál, ami szignálként működve aktiválja a többi DNS-javító enzimet. Mivel daganatos sejtek túlélése – különösen a BRCA-gént tartalmazóké – nagy mértékben függnek a PARP-rendszer javító funkciójától, a PARP-enzim gátlása fontos célpont lehet a daganatellenes kemoterápiában (3). A petefészekrák kezelése kapcsán az elmúlt években jelentős előrelépést hozott a PARP-inhibitorok (PARPi) alkalmazásának bevezetése highgrade szerózus petefészekrákos betegekben (4).

Ma már a Niraparib és az Olaparib is alkalmazási engedéllyel bír a BRCA-mutációt hordozó petefészekrák platina-érzékeny recidíváinak fenntartó kezelésében (5, 6, 7, 8).

A BRCA-mutáció kimutatására alkalmas molekuláris biológiai diagnosztika költséges. A mutációt hordozók esetében feltételezhető a PARP-rendszer aktivitásának kompenza­torikus emelkedése. Mindezek alapján felvetődik a kérdés, hogy a PARP-aktivitás megnövekedett volta egy olcsó és egyszerű módszerrel pótolhatja-e a költséges DNS-vizsgálatot?

Ennek megfelelően célul tűztük ki, hogy

• a PARP immunhisztokémiai vizsgálat során megállapított expressziós értékeket összehasonlítjuk BRCA-mutáns és BRCA-vad csoportok között Student-féle t-próbával, valamint

• összehasonlítjuk a BRCA-mutáns és BRCA-vad csoportokban mérhető 0 és 3+ közötti szemikvantitatív PARP-expressziós értékek megoszlását Pearson-féle khí-négyzet (χ²) próbával.

Anyagok és módszerek

Tanulmányunk során azoknak a betegeknek az adatait használtuk fel, akiknél 2014. január – 2016. december közötti időszakban a DE KK Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikán petefészekrákot diagnosztizáltak, vagy ez idő alatt petefészekrák miatt kemoterápiás kezelésben részesültek. A vizsgálatba azon betegek kerülhettek be, akiknél a BRCA-mutáció vizsgálata valamint a tumorszövet PARP immunhisztokémiai vizsgálata is megtörtént.

A germinális BRCA-vizsgálatok a DE ÁOK Labo­ra­tóriumi Medicina Intézet Klinikai Genetikai Tanszékén készültek. Ez a típusú genetikai vizsgálat meghatározott mutációkat keres. A BRCA-1 gén esetén 185delAg, 5382insC, T300G, míg a BRCA-2 gén esetén 6174delT, és 9326insA mutációk a leggyakoribbak. A vizsgálatokat bidirekcionális szekvenálással végeztük, perifériás vérből izolált DNS-mintákon. Három allél-specifikus PCR, illetve két PCR+RFLP módszer segítségével mutattuk ki, hogy az 5 leggyakoribb mutáció hiányát vagy jelenlétét. Amennyiben a szűrőtesztek kétséges eredményt adtak bidirekcionális szekvenálással igazoltuk a mutációk jelenlétét alvadásgátolt (EDTA, citrát) perifériás vérből.

A petefészekrákos tumorminták szövettani feldolgozása a patológiai diagnosztika rutin eljárási rendje szerint történt. Az immunhisztokémiai vizsgálatokat kutatásetikai engedély birtokában végeztük el (ETT 60355-2/2016/EKU). A műtéti anyagok fixálása 4% formaldehidet tartalmazó foszfát-puffer oldatban történt 24 órán át. A dehidrálást és paraffin beágyazást a szokványos protokoll szerint végeztük és a paraffin blokkokból 4 μm vastag metszeteket választottunk ki, amelyek tartalmazták a petefészektumor reprezentatív elemeit. A PARP protein kimutatására Leica Bond MAX Immunostainert (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) alkalmaztunk. A specifikus immunreakcióhoz kereskedelmi forgalomban hozzáférhető, nyúlban termelt poliklonális antitestet használtunk (ab6079 330, Abcam, Cambridge, UK). Az immunfestődés erősségét és eloszlását digitalizált fénymikroszkóppal értékeltük (Leica DM2500 microscope, DFC 420 camera and Leica Application Suite V3 software; Leica). A festődés intenzitásának értékelésére négyfokú skálát (0–3+) alkalmaztunk, melyben „0” jelöli a festődés teljes hiányát, a „3+” pedig az erős és egyenletes magfestődést. A festődést „2+” erősségűnek értékeltünk, ha az egyértelmű pozitív eredmény alul maradt a maximális festődéshez képest. Ezzel szemben, „1+” jelzéssel értékeltük azokat az eseteket, ahol a festődés teljes hiányától eltérően gyenge jelölés egyértelműen kimutatható volt, de a „2+” esetekhez képest nem egyenletes eloszlással.

A PARP immunhisztokémiai vizsgálat során megállapított expressziós értékeket Student-féle t-próbával hasonlítottuk össze a BRCA-mutáns és BRCA-vad csoportok között. A BRCA-mutáns és BRCA-vad csoportokban mérhető 0 és 3+ közötti szemikvantitatív PARP-expressziós értékek megoszlását Pearson-féle khí-négyzet (χ2) próbával hasonlítottuk össze. A statisztikai próbával kimutatható különbséget szignifikánsnak tekintettük p<0,05 érték esetén.

Eredmények

Tizennyolc beteg esetében álltak rendelkezésünkre komplett BRCA- és PARP-adatpárok. A BRCA-mutáns csoportban az átlagéletkor 50 év volt (medián 55,5 év), a BRCA-vad csoportban pedig 49,25 év (medián 54,5 év). Szövettani diagnózis minden beteg esetében highgrade serosus cystade­nocarcinoma ovari volt. A betegek mindegyike előrehaladott stádiumban került felismerésre, illetve műtétre (FIGO-stádium III/B-III/C). A 18 regisztrált esetből BRCA-stá­tuszuk alapján 6 beteg került a BRCA-mutáns csoportba, 12 beteg pedig a BRCA-vad csoportba.

A PARP immunhisztokémiai vizsgálatok során észlelt negatív (0), közepesen erős (2+) és erős (3+) festődésű esetek demonstratív példáit az 1. ábra mutatja be (1. ábra).

1. ábra PARP immunhisztokémiai vizsgálat reprezentatív mikrofotói negatív (A), közepesen erős (2+ és erős PARP-festődés (3+) esetén. A négyfokú aktivitás erősségi skálán (0–3+) értékelve a sejteket, „0” jelöli a festődés teljes hiányát (kék magfestődés), míg a „3+” az erős és egyenletes magfestődést (sötétbarna)

A BRCA-státusztól függetlenül, a teljes vizsgálati populációban 43% volt a PARP-pozitív tumorsejtek aránya (1. táblázat). Alcsoportokra bontva: a BRCA-mutáns csoportban 38%-os értéket, a BRCA-vad csoportban 49%-os értéket kaptunk. A két csoport PARP-pozitív tumorsejtek aránya Student-féle t-próbával nem mutatott jelentős különbséget (p=0,661.)

1. táblázat PARP-expresszió aránya petefészekrákból vett szövetmintákban

A PARP-festődés mértékét 0 és 3+ szélső értékek közötti aktivitási skálán mérve az átlagos intenzitás 1,389+ volt. A paramétereket alcsoportok szintjén vizsgálva, a BRCA-vad típusba tartozók csoportjában a PARP-expresszió erőteljesebbnek mutatkozott (2. táblázat). A két csoportban mért PARP-expresszió értékeinek megoszlása a Pearson-féle χ2-próbával nem mutatott jelentős különbséget (p=0,289).

2. táblázat PARP-expresszió mértéke germinális BRCA-heterozigóta és BRCA-vad csoportokban

Megbeszélés

A PARP-enzimcsalád jelentős szerepet játszik az egyszálú DNS-törés javításában. A BRCA 1/2 fehérjék – mint tumorszuppresszor gének termékei – a DNS kettős szálú töréseinek javításában vesznek részt. Ha a PARP-rendszert PARPi-kezeléssel gátoljuk, akkor homológ DNS-reparáció nagyobb terhelésnek van kitéve, hiszen a szimpla szálú törések előbb-utóbb kettős szálú törésekké alakulnak. A BRCA-gének mutációjának jelenlétében ez a jelenség „kettős letalitást” eredményez (2. ábra). Ez a számos Nobel-díjat és Nature folyóirat 2010-es „az év felfedezése” címet kiérdemelt felfedezés úgy is értelmezhető, hogy a kettősszálú DNS-törés javítása örökletes defektusának érvényre jutásában a PARP-aktivitás lecsökkenése döntő szerepet játszik. Logikailag ez azt is jelenti, hogy a PARP-rendszer aktivitása kompenzálólag hat a hiányzó BRCA-aktivitás okozta DNS-reparációban. Ez a feltételezett kompenzáció nem volt megfigyelhető az általunk végzett PARP immunhisztokémiai vizsgálatok során.

2. ábra A PARP-enzimek és a BRCA-fehérjék szerepe. A PARP gátlása következtében a szimpla szálú DNS-törések száma növekszik és többségük a reparáció hiányában dupla szálú DNS-töréssé alakul. Amennyiben a BRCA fehérjék működéses, azaz a homológ rekombinációs reparáció mutáció miatt hiányos, akkor a daganatsejt „kettős letalitás” hatása alatt áll

PARPi típusú gyógyszerekkel növelhető a BRCA-mutációval rendelkező, petefészek-daganattal diagnosztizált betegek progressziómentes túlélése. Fong és munkatársai voltak az elsők, akik megerősítették ezt az összefüggést, demonstrálva ezt BRCA 1/2 mutációval asszociált mell-, petefészek-, és prosztatarákos betegeknél, akik olaparib terápiában részesültek. A kezelés 63%-os valószínűséggel klinikai hasznot hozott a résztvevő betegeknek. Ez a homológ rekombinációs diszfunkció (HRD) – mint funkcionális biomarker – széles körű felismeréséhez vezetett és utat nyitott egy még bonyolultabb, még drágább molekuláris bio­marker vizsgálathoz, ami a HRD jelenlétét BRCA-negatív esetekben is ki tudja mutatni. Ebből származik BRCA-szerű viselkedés (BRCA-ness) kifejezés, ami feno­típusosan egyenértékű a BRCA-mutáció jelenlétével. Több folyamatot is azonosítottak, amelyek redukálják a BRCA 1/2 funkcióját, így eredményezve egy BRCA-szerű viselkedést. Ilyen a BRCA1 promóter metilációja, a Fanconi F-gén metilációja vagy a Fanconi D2 hiánya/redukciója. A PTEN tumor­szuppresszor gén funkcióvesztése is a BRCA-szerű viselkedést okozó változásnak bizonyul egyre több mell-, és prosztatarákban (4).

Ledermann és munkatársai a highgrade szerózus petefészekrákkal diagnosztizált betegeknél vizsgálták az olaparib daganatellenes hatását, az öröklött BRCA 1/2 mutációk jelenlététől függetlenül. Randomizált, dupla vak, placebo­kontrollált, 2. fázis tanulmányban vizsgáltak olyan platina­szenzitív, rekurrens, highgrade szerózus petefészekrákkal diagnosztizált betegeket, akik legalább 2, vagy több platinaalapú kezelési protokollban részesültek. A randomizált vizsgálatban napi 2×400 mg dózisú olaparib kezelést (136 beteg) hasonlították össze placebóval (129 beteg). Bár a teljes túlélésben nem volt különbség, a progressziómentes túlélési idő (PFS) szignifikánsan hosszabb volt az olaparib alkalmazása esetében (medián PFS 8,4 hónap vs. 4,8 hónap) (5).

Oza AM és munkatársai az olaparib daganatellenes hatását vizsgálták platinaszenzitív, rekurrens, highgrade szerózus petefészekrákos betegek esetében. Randomizált, nyílt, 2. fázis tanulmányban a betegek olaparib (200 mg 2× naponta 21 napig), paclitaxel (175 mg/m²) és carboplatin (AUC 4 mg/ml) kombinációs kezelést követően olaparib monoterápiában részesültek (400 mg 2× naponta) (első csoport, 66 fő),vagy csak paclitaxel (175 mg/m²) és carboplatin (AUC 6 mg/ml) kombinációs kemoterápiát kaptak (második csoport, 55 fő). Százhét beteg BRCA mutációs státusza volt ismert, amelyet retrospektíve vizsgáltak. A BRCA-mutációt hordozó 41 fő közül 20 fő került az első, 21 fő pedig a második csoportba. A progressziómentes túlélési időt (PFS) tekintve szignifikánsan hosszabb időszakot mértek az első csoportnál (medián PFS 12,2 hó vs. 9,6 hó). Ez a PFS növekedés különösen a BRCA mutációval rendelkező betegek esetében dominált (6).

A PARPi-készítmények alkalmazásakor tapasztalt mellékhatások önálló vagy kombinációs terápiában való alkalmazhatóságuknak még gátat szabhat. Shahneen és munkatársai egy rokon vegyület, a niraparib hatékonyságát 1. fázis dózis eszkalációs tanulmányban elemezték. A farmakodinámiás vizsgálatok megerősítették, hogy 80 mg/nap felett megvalósult a PARP-rendszer gátlása, és az antitumor aktivitást 60 mg/nap felett már detektálni lehetett. A kezelések során maximálisan tolerálható dózisként 300 mg/nap niraparib alkalmazását állapították meg (7). Fontos megemlíteni, hogy kedvező eredményű 2. és 3. (NOVA) vizsgálati fázisú eredmények alapján az FDA (U.S.FOOD & DRUG ADMINISTRATION) a közelmúltban jóváhagyta a niraparib alkalmazását azoknál a betegeknél, akiknél rekurrens epitheliális petefészekrákot, petevezeték-, vagy primer peritoneális rákot diagnosztizáltak, és a platinaalapú kemoterápiákra teljes vagy részleges választ adtak. A germ­line BRCA mutációval rendelkező betegek közül azoknál, akik niraparib kezelésben részesültek, a medián PFS értéke lényegesen hosszabb volt, mint a placebocsoporté (21 hó vs. 5,5 hó). A germline BRCA mutációval nem rendelkező betegek esetében medián PFS értéke szintén hosszabb volt a niraparib kezelésben részesülő betegek esetében ( 9,3 hó vs. 3,9 hó) (8).

A DEKK Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikán e szerek közül az olaparib az egyetlen, amelyet néhány rekurrens, highgrade petefészekrákkal diagnosztizált beteg esetében már alkalmaztunk, de csak többedik vonalbeli kezelésként. A ma már egyedi méltányosság alapján beszerezhető szer alkalmazásának gátat szab az alkalmazási előiratban feltételül szabott BRCA-mutáció jelenléte. Bár gyógyszeripari támogatással a DNS-vizsgálat elérhető, sok esetben az időbeli megkötés (platinabázisú kezelés befejezését követően 40 napon belül el kell kezdeni a kezelést) teszi nehézkessé a genetikai eredmény beszerzését.

Lényegében e nehézségek vezettek bennünket arra, hogy a genetikai vizsgálat PARP-expressziós vizsgálattal való kiválthatóságát tegyük kutatás tárgyává. Irodalomkutatásunk eredménye, illetve tudomásunk szerint ezt a hipotézist mások még nem vizsgálták. A PARPi-kezelés bizonyítottan azokban az esetekben a leghatásosabb, amikor BRCA-mutáció van jelen. A farmakodinámiás vizsgálatok dózis-hatás korrelációt is igazoltak. Ezek alapján feltételeztük, hogy a gátlószer alkalmazása leginkább akkor lehet hatásos, ha az általa gátolt működés a normálishoz képest fokozott. Logikusnak tűnt tehát az a hipotézis, hogy BRCA-mutáció hordozókban intenzívebb lehet a PARP-rendszer működése, s annak gátlása kedvezőbb tumorválaszt eredményez, mint alacsonyabb PARP-aktivitással bíró BRCA-negatív tumorok esetében.

Eredményeinkből világosan látható, hogy a PARP-rendszer BRCA-mutációban feltételezett kompenzáló szerepe nem igazolható, hiszen a BRCA-heterozigóta csoportban nem mutatható ki szignifikánsan nagyobb PARP-pozitivitás, mint a BRCA-vad csoportban (p=0,661). A szemikvantitatív expressziós értékek eloszlását tekintve sem sikerült jelentős különbséget kimutatni a két csoport között (p=0,289). Ugyanakkor, megállapítható, hogy mindkét csoportban kimutatható fokozott PARP-expresszió. Ez részben mégis csak alátámaszthatja hipotézisünket és magyarázatot adhat arra a megfigyelésre, hogy a platinabázisú kemoterápiát követően alkalmazott fenntartó PARPi-kezelés BRCA-negatív betegekben is javítja a kiújult petefészekrák progressziómentes túlélését placebóhoz képest.

Következtetés

BRCA-mutációt hordozó petefészekrákos betegek tumorszövetében a PARP-expresszió jelentősen nem különbözik a BRCA-vad típusú betegekben kimutatható szinttől, mindkét betegcsoportban emelkedett PARP-aktivitás észlelhető. Eredményeink alapján a PARPi-kezelésre való alkalmasság előrejelzésére, illetve a BRCA genetikai vizsgálat funkcionális helyettesítésére a PARP immunhisztokémia nem alkalmas. További vizsgálatokat igényel annak tisztázása, hogy a PARP-expresszió mértéke milyen kapcsolatban áll a klinikai lefolyással.